Plateau de synthèse et de purification d’oliginucléotides
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Les équipes de l’Institut Pasteur de Chimie Bio-organique des acides nucléiques ont développé une plateforme expérimentale pour synthétiser et purifier des oligonucléotides.
Marcel Hollenstein, Institut Pasteur, responsable du laboratoire de Chimie Bio-organique des Acides Nucléiques nous parle de ce plateau.
Quels sont les objectifs de cette plateforme de l’Institut Pasteur?
Notre installation de synthèse et de purification d’oligonucléotides vise à produire des séquences chimiquement modifiées allant de 2 à environ 100 nucléotides. Ces oligonucléotides modifiés sont des éléments clés de notre projet PEPR, car la modulation du pH affecte particulièrement les nucléotides modifiés.
Par conséquent, une modification du pH changera directement la nature du nucléotide qui sera incorporé par les polymérases via des modifications matricielles. De telles séquences modifiées seront également utilisées dans des approches basées sur la ligase pour construire des séquences encore plus longues (c’est-à-dire jusqu’à 1000 nucléotides), ce qui est l’objectif principal de notre projet.
En outre, notre installation peut préparer des oligonucléotides avec des motifs de modification alternatifs intéressants pour tous les membres de notre consortium. Cela inclut des modifications terminales 5’/3′ telles que la biotine ou le thiol pour immobiliser les séquences sur des surfaces comme des électrodes ou des particules magnétiques, des sites abasiques ou des bases universelles pour bloquer les polymérases ou favoriser l’introduction de tout type de nucléotide, respectivement, ou d’autres étiquettes fonctionnelles.
Comment fonctionne ce plateau technique?
Après la conception des séquences, directement dans notre laboratoire ou par nos collaborateurs, nous synthétisons ensuite les amidites modifiés s’ils ne sont pas disponibles commercialement. Il s’agit d’un projet de synthèse en plusieurs étapes incluant une purification approfondie et une analyse de l’intégrité chimique de tous les intermédiaires et produits finaux. Avec tous les amidites en main, nous initiions ensuite la synthèse des séquences en utilisant notre synthétiseur d’ADN K&A.
Après achèvement de la synthèse, le support solide est traité avec de l’ammoniac pour retirer les groupes protecteurs et détacher la séquence de la résine.
Après élimination de l’ammoniac, les séquences sont purifiées par RP-HPLC et/ou chromatographie échangeuse d’anions HPLC.
Enfin, les oligonucléotides modifiés sont soumis à une analyse par LC-MS et/ou MALDI-ToF avant quantification. Les séquences peuvent ensuite être envoyées aux collaborateurs ou utilisées en interne pour des applications en aval.
Quelques images du plateau technique
Quelle a été la genèse de ce plateau technique?
Initialement, les séquences étaient synthétisées par un doctorant et un chercheur permanent du CNRS au cas par cas. Après l’embauche d’un ingénieur de recherche fin 2024 dans le cadre de ce projet du PEPR MoleculArXiv, l’installation a fortement amélioré sa capacité. Nous sommes actuellement sur le point d’acquérir un nouveau synthétiseur d’ADN pour encore augmenter notre capacité de production.
Durée pour la synthèse d’oligonucléotides modifiés
La durée exacte de la synthèse d’une séquence modifiée dépend d’un certain nombre de paramètres, y compris la longueur de la séquence, le nombre de nucléotides modifiés à incorporer, et si les modifications sont disponibles commercialement ou si elles doivent être produites. Dans le pire des cas, c’est-à-dire une longue séquence (~92 nucléotides) avec plusieurs modifications qui ne sont pas disponibles commercialement, au moins deux mois doivent être envisagés du début à la fin. Dans le meilleur des cas, c’est-à-dire des modifications standard sur une courte séquence (~15 nucléotides que nous préparons pour une autre partie de notre projet), la durée ne dépasse pas 10 jours.
Quel est l’intérêt de cette plateforme pour le PEPR?
Comme mentionné précédemment, les oligonucléotides modifiés sont au cœur du projet PEPR, car ils représentent les matrices qui dicteront la nature des oligonucléotides produits par les polymérases en fonction des changements de pH. En plus de ces matrices plus longues, nous avons initié une vaste analyse de l’effet des modifications de bases sur la stabilité des duplex en fonction du pH et des appariements erronés.
Nous pensons que les résultats issus de cette vaste analyse faciliteront l’identification de modifications de bases alternatives à utiliser dans des matrices plus longues.
Potentiellement, la grande quantité de données pourrait être implémentée dans des algorithmes pour prédire l’effet du pH sur les modifications de la capacité d’appariement erroné.
Quelles sont les perspectives de ce plateau technique ?
Depuis l’embauche de l’ingénieur de recherche, l’installation a atteint un nouveau niveau de maturité. Nous avons également pu produire certains oligonucléotides modifiés qui n’étaient que faiblement liés au projet PEPR (par exemple, pour le marquage chimio-enzymatique d’oligonucléotides avec des ligands GalNAc en collaboration avec l’équipe de Yannick Rondelez) et des collaborateurs externes.
Nous continuerons à produire des oligonucléotides pour le projet PEPR et envisageons de mettre en œuvre des modifications du squelette et du sucre pour évaluer leur dépendance aux altérations du pH. L’avenir de l’installation dépend évidemment fortement de la présence de notre ingénieur hautement qualifié.
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